Ассоцированная микробиота рыб и микробиота цестод на разных стадиях жизненного цикла  Рыбинского водохранилища

Кишечная микробиота щуки Esox lucius. По результатам секвенирования V3-V4 региона гена 16S рРНК наибольшее количество вариантов последовательностей ампликонов (amplicon sequence variant, ASV) и разнообразие бактерий по индексу Шеннона отмечено для ассоциированной микробиоты слизистой и содержимого желудка незараженных щук (ASV: 22.8±6.5 и 37.0±15.5, Шеннон: 1.0±0.2 и 1.5±0.4, соответственно), наименьшее – для слизистой кишечника незараженной щуки (ASV: 9.8±3.4, Шеннон: 0.5±0.2). Достоверных отличий по количеству ASV и индексу Шеннона между кишечной микробиотой зараженных и незараженных щук не выявлено (тест Данна, p>0.05). В составе микробиоты слизистой и содержимого желудка зараженной и незараженной щуки из Рыбинского водохранилища доминировали Mycoplasma и Cetobacterium. В качестве субдоминантов в желудке зараженной щуки отмечены Undibacterium, Shewanella и Yersinia, а в желудке незараженных рыб, - Flavobacterium и Iodobacter. В микробиоте различных отделов кишечника зараженных и незараженных рыб отмечен сходный состав доминантов, с высоким обилием выявлены Acinetobacter, Anaerorobacillus, Mycoplasma и Cetobacterium (рис.). 

Микробиота половозрелых цестод T. nodulosus, паразитирующих в кишечнике щуки. Число ASV в смывах бактерий с тегумента цестод достоверно не отличалось между собой (тест Данна, p>0.05) и варьировалось в пределах 8.3±2.1 – 13.8±2.4. Значения индекса Шеннона, напротив, достоверно отличались при сравнении смывов D7 со смывами D1, D2 и D7 (тест Данна, p≤0.05). В ассоциированной микробиоте половозрелых цестод T. nodulosus, паразитирующих в кишечнике щуки, доминировали Mycoplasma и Cetobacterium, причем относительное обилие Cetobacterium в ряду смывов D0-D4 увеличивалось, а обилие Mycoplasma – снижалось. Начиная со смыва D3 и заканчивая D5 в микробиоте цестод появляются Acinetobacter, Novosphingobium и Flavobacterium. В микробиоте D6 снова доминируют только Mycoplasma и Cetobacterium. Во фракции D7 (черви после всех смывов) доминировали Anaerorobacillus, Cetobacterium и Enteroccous.

Микробиота плероцеркоидов T. nodulosus, паразитирующих в печени окуня. Число ASV и разнообразие по индексу Шеннона в микробиоте плероцеркоидов T. nodulosus и микробиоте печени достоверно не отличалось между собой и варьировало от 8.9 до 21.8 и 1.8 до 2.8, соответственно. Ассоциированная микробиота плероцеркоидов T. nodulosus, паразитирующих в печени окуня, существенно отличалась от состава бактерий, выявленных у половозрелых цестод из кишечника щуки. Так в микробиоте плероцекоидов T. nodulosus доминировали Anaerobacillus, Corynebacterium и Staphylococcus. В печени зараженных окуней в большом количестве выявлены Anaerobacillus, в печени неараженных рыб, напротив, доминировали Staphylococcus. Бактерии рр. Cetobacterium и Pedobacter выявлены только в печени зараженных рыб, а Paracoccus отмечен в печени только у незараженных рыб (рис. 9.1).

Рисунок 9.1. Относительное обилие бактерий на уровне рЫода в микробиоте плероцеркоидов T. nodulosus, паразитирующих в печени окуня, и половозрелых T. nodulosus из кишечника щуки из Рыбинского водохранилища.

Основные исполнители: Власенко П.Г., н.с., Кашинская Е.Н., с.н.с., к.б.н. Хоменко Ю.С., м.н.с., Симонов Е.П., с.н.с., к.б.н.,  Соловьев М.М., в.н.с., к.б.н. Тематическая группа физиологии и генетики гидробионтов.

Ассоцированная микробиота рыб и микробиота цестод на разных стадиях жизненного цикла  Телецкого озера

Кишечная микробиота щуки Esox Lucius. Наибольшее количество ASV и разнообразие бактерий по индексу Шеннона отмечено для ассоциированной микробиоты содержимого желудка зараженных щук (ASV: 34.5±6.2, Шеннон: 1.6±0.3), наименьшее – для слизистой первого отдела кишечника зараженной щуки (ASV: 15.5±1.5, Шеннон: 1.4±0.1). Микробиота слизистой и содержимого желудка зараженных щук характеризовалась сходным составом доминантов. В составе микробиоты слизистой и содержимого желудка зараженной щуки из оз. Телецкое доминировали Aeromonas, Cetobacterium, Clostridium sensu stricto1, Hafnia-Obesumbacterium и Silvanigrella. В то же время для незараженных рыб состав доминантов в слизистой и содержимого желудка существенно отличался. Так, в содержимом желудка отмечены Halomonas, Helicobacter, Pseudarciella, Pseudomonas и Streptococcus, в слизистой доминировали Alcanivorax, Erysipelothrix, Flavobacterium и Ralstonia. В содержимом различных отделов кишечника зараженных щук преобладали Cetobacterium и Hafnia-Obesumbacterium, в слизистой доминировали Cetobacterium и Mycoplasma. У незараженных рыб по сравнению с зараженными в содержимом кишечника доминировали Aeromonas, Candidatus Rhabdochlamydia и Epulopiscium, слизистая кишечника в основном представлена бактериями рр. Aeromonas и Cetobacterium (рис. ).

Микробиота половозрелых цестод T. nodulosus и T. crassus, паразитирующих в кишечнике щуки. Число ASV и разнообразие бактерий по индексу Шеннона в ассоциированной микробиоте цестод T. nodulosus было выше по сравнению с T. crassus, однако достоверных отличий по тесту Данна не наблюдалось (p>0.05). В Телецком озере в ассоциированной микробиоте половозрелых цестод T. nodulosus и T. сrassus, паразитирующих в кишечнике щуки, также доминировали Mycoplasma и Cetobacterium. Относительное обилие Cetobacterium в ряду смывов D0-D7 снижалось, а Mycoplasma, наоборот, увеличивалось. Для ассоциированной микробиоты T. nodulosus и T. сrassus также с высоким обилием отмечены Acinetobacter и Hafnia-Obesumbacterium, доля которых также снижалась в ряду смывов D0-D7.

Микробиота плероцеркоидов T. nodulosus и T. crassus, паразитирующих в печени и мышцах различных промежуточных хозяев. В микробиоте плероцеркоидов, паразитирующих в мышцах и печени вторых промежуточных хозяев (сиг Правдина, телецкий сиг, сибирский подкаменщик, хариус и налим) общими доминирующими таксонами бактерий выступали Acinetobacter, Anaerobacillus и Halomonas. Микробиота плероцеркоидов T. crassus сига Правдина и телецкого сига не отличалась между собой. Основные отличия в ассоциированной микробиоте плероцеркоидов T. nodulosus у различных промежуточных хозяев вносили бактерии рр. Erysipelothrix для сибирского подкаменщика, Serratia для хариуса и Neorickettsia для налима.

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые охарактеризована микробиота, ассоциированная с цестодами из р. Triaenophorus на разных стадиях развития (плероцеркоиды и половозрелые черви) и их промежуточных и дефинитивных хозяев из разнотипных водоемов России (олиготрофное Телецкое озеро и эвтрофное Рыбинское водохранилище). Микробиота цестод рода Triaenophorus на разных стадиях жизненного цикла (плероцеркоиды и половозрелые черви) характеризовалась различным составом бактериальных сообществ. Различия в составе бактерий, ассоциированных с цестодами рода Triaenophorus, прослеживались не только от стадии их жизненного цикла, но и от вида промежуточного хозяина и типа водоема. Среди общих доминантов, встречающихся в составе микробиоты половозрелых червей, выявлены Mycoplasma и Cetobacterium, а в микробиоте плероцеркоидов – Acinetobacter, Anaerobacillus и Staphylococcus. По результатам проведенных исследований показано, что микробиота, ассоциированная с плероцеркоидами цестод, достоверно не отличалась от микробиоты их капсул и мышц/печени, из которых были извлечены эти паразиты. В тоже время микробиота, ассоциированная с половозрелыми цестодами рода Triaenophorus из кишечника щуки, достоверно отличалась от микробиоты плероцеркоидов.

Рисунок. Относительное обилие бактерий на уровне рода в микробиоте половозрелых T. crassus и T. nodulosus из кишечника щуки из Телецкого озера.

Основные исполнители: Власенко П.Г., н.с., Кашинская Е.Н., с.н.с., к.б.н. Хоменко Ю.С., м.н.с., Симонов Е.П., с.н.с., к.б.н.,  Соловьев М.М., в.н.с., к.б.н. Тематическая группа физиологии и генетики гидробионтов.

Разнообразие метацеркарий трематод рода Diplostomum - паразитов массовых видов рыб оз. Чаны

Были исследованы метацеркарии от десяти видов рыб: сазана, серебряного и золотого карася, плотвы, ельца, язя, леща, окуня, судака и щуки. Всего получено 74 нуклеотидных последовательностей cox1 и 20 последовательностей кластера ITS1–5.8S-ITS2 длиной 595 и 949-1065 нуклеотидов соответственно. В результате филогенетического анализа все последовательности cox1 образовали 3 клады видового уровня с высокой поддержкой. Две из них, с локализацией метацеркарий в хрусталиках рыбы, были определены как D. spathaceum и D. pseudospathaceum. Третья клада сформирована последовательностями от метацеркарий из внутренней среды глаза была определена как D. volvens.

Всего от метацеркарий из глаз рыб оз. Чаны для фрагмента cox1 длиной 587 нуклеотидов отмечено 18 гаплотипов для D. spathaceum (Hd = 0,977±0,016, Pi = 0,008±0,0008), 29 гаплотипов для D. pseudospathaceum (Hd = 0,975±0,011, Pi = 0,0055±0,0005) и 5 гаплотипов для D. volvens (Hd = 0,933±0,122, Pi = 0,0064±0,0017).

pseudospathaceum зарегистрирован в хрусталиках всех исследованных видов рыб. Непосредственно из озера Чаны для этого вида зарегистрировано 29 гаплотипов при Hd = 0,975±0,011и Pi = 0,0055±0,0005. При использовании последовательностей из Генбанка для анализа распространения гаплотипов этого вида использовано выравнивание длиной 450 нуклеотидов. При анализе полученного выравнивания отмечено 32 гаплотипа. На медианной сети гаплотипов отчетливо выделяется центральный гаплотип, который был отмечен из Чанов, Румынии и Германии. Максимальная попарная p-дистанция для D. pseudospathaceumсоставила 0,0177±0,0036 при средней 0,0046 (Длина 453).

spathaceum обнаружен нами в хрусталиках восьми (сазан, серебряный и золотой караси, плотва, елец, язь, окунь, судак) видов. От исследованных нами метацеркарий отмечено 18 гаплотипов при Hd = 0,977±0,016 и Pi = 0,008±0,0008. После привлечения доступных данных из ГенБанка получено итоговое выравнивание длиной 425 нуклеотидов. На основании этого выравнивания отмечено 57 гаплотипов, из которых можно выделить 2, отмечаемые с наибольшей частотой. Эти гаплотипы отмечены из Чанов, Китая, Турции, Ирака и Украины. Также общие с Чанами гаплотипы отмечены из Германии. Наибольшее разнообразие гаплотипов отмечено в Ираке, где проходит зимовка птиц, зараженных маритами Diplostomumspp. Максимальная попарная p-дистанция D. spathaceum0,0189±0,0067 при средней 0,0058 (Длина 430).

volvens. Метацеркарии D. baericomplex sp. 2 обнаружены только во внутренней среде глаза окуня. Близкие к полученным нами последовательности были ранее отнесены к комплексу видов D baeriкак D. baeri Lineage 2’ (Georgieva et al., 2013). Однако Faltýnková et al. (2022) опровергли это определение. Было показано, что эти последовательности принадлежат трематодам, которые хоть и близки к D baeri морфологически, однако реализуют свой жизненный цикл через других вторых промежуточных хозяев и имеют другую локализацию внутри глаза. В целом, обнаруженные нами метацеркарии по своим признакам, таким как виды рыб-хозяев и локализация в глазах рыб, более соответствуют D. volvens в понимании Шигина (1993). В исследованном нами материале отмечено 5 гаплотипов для D baeri при Hd = 0,933±0,122 и Pi = 0,0064±0,0017. При использовании последовательностей из Генбанка для анализа распространения гаплотипов этого вида использовано выравнивание длиной 356 нуклеотидов. Всего для итогового выравнивания отмечено 32 гаплотипа. При анализе мединной сети гаплотипов можно выделить 3 центральных, которые помимо Чанов отмечены в Исландии, Германии, Норвегии и в Северо-Западной России. Максимальная попарная p-дистанция для D. baeri 0,02247±0,0078 (длина 356 п.н.), при средней 0,00856.

Рисунок. Филогенетическое дерево для последовательностей cox1, построенное методом максимального правдоподобия. В качестве аут группы использованы последовательности Tylodelphys clavata.

Основные исполнители: Власенко П.Г., н.с., Кашинская Е.Н., с.н.с., к.б.н. Хоменко Ю.С., м.н.с., Симонов Е.П., с.н.с., к.б.н.,  Соловьев М.М., в.н.с., к.б.н. Тематическая группа физиологии и генетики гидробионтов.